شمارش گلبول های سفید یا گلبول های قرمز خون

مقدمه:
برای تعیین تعداد جمعیت سلولی از روش شمارش میکروسکوپی توسط میکروسکوپ نوری استفاده می شود. شمارش می تواند شامل شمارش اجسام میکروسکوپی یک جمعیت سلولی مثل جمعیت باکتریایی یا جمعیت مخمری یا سلول های قرمز یا جمعیت رشد جلبکها باشد. کاربرد دیگر این روش، اندازه گیری میزان رشد یک سوسپانسیون یا جمعیت سلولی می باشد. هم چنین برای شمارش گلبول های خونی در واحد سطح و حجم از این روش استفاده می شود. به دلیل این که شمارش یک روش آماری و تصادفی است، آن قدر باید انجام شود و میانگین گرفته شود تا نتیجه نهایی اعلام شود. در این روش نمونه مورد شمارش ابتدا باید با رقت مناسب در محلول رقیق کننده مناسب تهیه شود. محلول رقیق کننده حتما باید متناسب با شرایط نمونه تهیه گردد که می تواند محلول نمکی ایزوتونیک، یک مایع تثبیت کننده، محیط کشت مناسب، گلوکز استریل و... باشد که شرایط طبیعی نمونه را حفظ کند و نمونه دچار آسیب، تغییر شیمیایی، به هم چسبندگی و... نگردد.
(محلول رقیق کننده,گلبول هایی را که می خواهیم بشماریم را از بین نبرد.اجزاء گلبول ها را در جهت شمارش مشخص نماید.در شمارش گلبول های قرمز از محلول 2 درصد کلروسدیم استفاده می کنیم این یک محلول هیپرتونیک می باشد و گلبول ها از هم مجزا می شود.در شمارش گلبول های سفید از محلول مارکانو استفاده می شود که تشکیل شده از اسید استیک 2درصد(باعث انحدام گلبول های قرمز می شود) و یک رنگ به نام ویوله دوژانسین(هسته های گلبول سفید به رنگ بنفش می شود).)
لام مخصوص: برای اندازه گیری تعداد نمونه در واحد حجم احتیاج به وسیله یا لامی است که حجم مشخصی را برای شمارش در اختیار آزمایش کننده قرار دهد. در این آزمایش از لام هموسیتومتر استفاده می گردد.لام های مخصوص شمارش گلبول های خون انواع مختلفی دارند مانند لام توما، نئوبار، اسپنسر، تورک و ... که توسط کارخانه های مختلف عرضه می شوند ولی لام هموسیتومتری که از همه دقیق تر و بهتر است، لام نئوبار می باشد. لام هموسیتومتر صفحه شیشه ای نسبتا ضخیمی است که سطح آن توسط شیارهایی به چند قسمت تقسیم می شود به طوری که دو شیار کناری و یک شیار وسط شکلی شبیه H را می سازند. در وسط دو مستطیل میانی دو بخش براق و آیینه مانند دیده می شود که دو صفحه مشبک مانند(+) را پوشش می دهند. دو صفحه مشبک مانند در بالا و پایین لام تکرار شده و مشابه می باشند. بدین ترتیب با یک بار تهیه لام، شما دوبار قادر هستید که نمونه ها را به طور تصادفی مورد شمارش قرار داده و میانگین تصادفی دو بار شمارش را به صورت عدد نهایی گزارش کنید. بخش مدرج از تعداد زیادی خطوط موازی جهت شمارش تشکیل شده است. در هر کدام از این صفحات 9 مربع بزرگ به ابعاد یک میلی متر در یک میلی متر وجود دارد. مربع میانی خود به 25 مربع متوسط و هر مربع متوسط نیز به 16 مربع کوچک تقسیم شده است( هر 16 مربعی توسط خطوط مضاعف محصور شده است.) به عبارتی مربع بزرگ به 400 مربع کوچک تقسیم شده است. زمانی که لامل روی لام قرار گیرد، ارتفاع هر صفحه مدرج تا لامل 0/1 میلی متر خواهد بود. پس حجم ایجاد شده در این فضا 0/1میلی متر مکعب می باشد. در چهار گوشه صلیب مدرج، چهار مربع دیگر به ابعاد یک میلی متر در یک میلی متر به چشم می خورد که تقسیمات آن با مربع بزرگ میانی متفاوت است. پس هریک از اضلاع این مربع ها به چهار بخش تقسیم شده است، یعنی هر مربع کناری، 16 مربع کوچکتر را تشکیل می دهد که این مربع ها برای شمارش گلبول های سفید (که تعداد آن ها از گلبول های قرمز کمتر است) به کار می روند.
لام هموسیتومتر توما مانند لام هموسیتومتر نئوبار است با این تفاوت که چهار مربع کناری را ندارد و فقط دارای مربع مرکزی مخصوص شمارش گلبول های قرمز می باشد.


ملانژور با حباب قرمز جهت شمارش گلبولهای قرمز خون
ملانژور با حباب سفید جهت شمارش گلبولهای سفید خون
پیپت مخصوص جهت اندازگیری هموگلوبین خون
پیپت ملانژور مخصوص شمارش گلبول های قرمز: هر پیپت دارای یک قسمت حباب مانند و یک قسمت موئینه می باشد. روی این پیپت سه عدد 0/5، 1 و 101 به ترتیب نوشته شده است به طوری که دو عدد 0/5 و 1 در زیر حباب و 101 در بالای حباب قرار دارند. در داخل حباب یک گرانول قرمز رنگ برای مخلوط کردن خون با مایع رقیق کننده وجود دارد. این ملانژور می تواند خون را به نسبت 1 به 200 رقیق کند( اگر تا عدد 1 خون و سپس تا عدد 101 محلول رقیق کننده وارد پیپت شود، خون به میزان صد برابر رقیق شده است و در صورتی که تا عدد 0/5 خون و سپس تا عدد 101 محلول رقیق کننده وارد شود، خون به میزان 200 برابر رقیق شده است.).
پیپت ملانژور مخصوص شمارش گلبول های سفید: دارای سه عدد 0/5، 1 و 11 می باشد که دو عدد 0/5 و 1 در زیر حباب و 11 در بالای حباب قرار دارند. داخل حباب یک گرانول سفید رنگ برای مخلوط شدن خون با محلول رقیق کننده وجود دارد. این ملانژور می تواند خون را به نسبت 1 به 20 رقیق نماید (اگر تا عدد 1 خون و تا 11 رقیق کننده وارد شود، خون 10 برابر رقیق شده است و اگر تا عدد 0/5 خون و تا 11 رقیق کننده وارد شود، خون به میزان 20 برابر رقیق خواهد شد.).
لوله لاستیکی تورنیکت: جهت مکیدن خون و محلول رقیق کننده به درون ملانژور استفاده می شود. این لوله 25-12 سانتی متر طول دارد تا در هنگام کشیدن خون و محلول، چشم قادر به دیدن درجات باشد. از طرفی جدار لوله پلاستیکی باید از جنسی مقاوم باشد تا در هنگام مکش خون روی هم نخوابد.

محلول رقیق کننده: می تواند محلول هایم (محلول ایزوتونیک) یا سالین 2 درصد باشد. برای تهیه سالین 2 درصد می توان 2 گرم نمک طعام را در 100 میلی لیتر آب حل نمود. این محلول نسبت به محلول داخل سلولی هیپرتونیک است. علت استفاده از محلول رقیق کننده، زیاد بودن تعداد گلبول های قرمز و عدم توانایی در شمارش آنها می باشد، پس باید آن ها را رقیق کرد. هرچه تراکم بیشتر باشد، رقت نیز باید بیشتر گردد. پس بهتر است در شمارش گلبول های قرمز از رقت 200 استفاده شود.
مواد و وسایل مورد نیاز:
میکروسکوپ، لام هموسیتومتر(نئوبار)، لامل سنگی، ملانژور مخصوص شمارش گلبول های قرمز، تورنیکت، پنبه، الکل، لانست، محلول رقیق کننده.
روش انجام آزمایش:
مقداری از محلول رقیق کننده را در بشر کوچکی می ریزیم زیرا بعد از آزمایش دور ریخته می شود. از خون گرفته شده توسط لانست استفاده می کنیم. لانست زدن را با یک ضربه سریع و محکم روی انگشت ضد عفونی شده با الکل (خشک شده) انجام داده و خراش مناسب را ایجاد می کنیم.
نوک پیپت ملانژور را با زاویه 45 درجه در قطره خون قرار داده و توسط تورنیکت خون را تا علامت 5/0به درون پیپت می کشیم. می توانیم پیپت را با پایین تر نگه داشتن آن از حالت افقی و توسط نیروی کشش زمین نیز پر کنیم. اگر خون بالاتر از خط مورد نظر قرار گرفت، با قرار دادن پنبه ای در دهانه پیپت اضافی آن را خارج می کنیم. دقت شود که نوک پیپت از روی قطره خون روی انگشت خارج نشود تا حباب هوا وارد پیپت نگردد. در صورت ورود هوا در پیپت دمیده و خون را خارج و عملیات را مجددا تکرار می کنیم. هم چنین از فشار دادن موضع جلوگیری می کنیم زیرا سبب خروج آب میان بافتی و رقیق شدن خون می شود. سپس اطراف پیپت را تمیز نموده و آن را وارد ظرف حاوی محلول رقیق کننده کرده و تا علامت 101 پیپت را پر می کنیم. رقیق کردن خون باید به سرعت انجام شود، در غیر این صورت خون در پیپت لخته خواهد شد. پس از مخلوط شدن خون با محلول رقیق کننده، دیگر خطر انعقاد وجود ندارد. تورنیکت را از ملانژور جدا نموده و با دو انگشت شست و سبابه دو انتهای ملانژور را گرفته و 5 دقیقه تکان می دهیم تا خون به خوبی با محلول رقیق کننده در حباب مخلوط شود. 4-3 قطره از محتویات ملانژور را دور ریخته (زیرا لوله باریک ملانژور فقط حاوی محلول رقیق کننده است.) و قطره پنجم را به حدفاصل لام و لامل تماس می دهیم. طبق خاصیت موئینگی مایع رقیق شده بین لام و لامل پخش می شود(در صورت لزوم لامل را کمی از دو طرف در محل تکیه گاه فشار داده تا اگر مایع اضافی زیر لامل است به شیارهای دوطرف بریزد و یا اگر دارای حباب هوا است، حباب از محوطه خارج شود.).

پس از قرار دادن قطره پنجم کمی صبر می کنیم تا گلبول ها بی حرکت شوند و با تغییر فاز میکروسکوپ، گلبول ها را به صورت واضح می یابیم. گلبول های موجود در چهار خانه کناری و یک خانه وسطی از 25 خانه مربع متوسط را می شماریم. برای جلوگیری از شمارش تکراری، گلبول های موجود بر روی خطوط سه گانه سمت چپ و بالا را شمرده و هم چنین گلبول های موجود در 16 خانه کوچک را به طریق زیکزاکی می شماریم.

در پایان آزمایش، پس از تخلیه محتویات باقی مانده در پیپت، آن را با آب شستشو می دهیم. سپس با ورود و خروج الکل، آب باقی مانده در پیپت را خارج می کنیم و در نهایت پیپت را با استون یا مواد مشابه آن شستشو داده تا الکل را خارج نماید. سپس لوله ها را توسط هوای فشرده یا مکیدن هوا از داخل آن خشک می کنیم. در صورتی که ملانژور خشک شده باشد، گرانول به کناره های حباب نخواهد چسبید.
در آزمایشگاه هرگز لام هموسیتومتر را با الکل یا اتر شستشو ننمایید. لام را با آب مقطر و یک پارچه کتانی جاذب رطوبت و بدون پرز تمیز نمایید.
گلبول قرمز(R=5) و رقت 200/1:
مساحت یک مربع کوچک: 1/20× 1/20= 1/40mm2
حجم یک مربع کوچک: 1/40× 1/10= 1/4000mm3
حجم خونی که ما در یک مربع کوچکRBC آن را شمارش کرده ایم:
1/4000× 1/200 = 1/800000mm3
مقدار خونی که ما کلا RBC شمارش کردیم:    1/800000× 80=1/10000mm3
مربع کوچک شمارش شده ×16=80 5
N=تعدا دکلی که ما به دست آوردیم: N= N1+N2+N3+N4+N5
1/10000= n
X=10000 × N    X=تعداد گلبول بدون رقت در 1mm3خون
گلبول سفید:
1× 1=1   و 1× 1/10=1/10 و 1/10× 1/20=1/200 و 1/200× 4=1/50 و   x=n×50
خطاهای آزمایش :
-1 اشکالات تکنیکی : از جمله این اشکالات می توان از نمونه گیری غلط مثل کند بودن جریان خون از محل نمونه گیری که میتواند بعلت نازک بودن سوزن سرنگ مصرفی باشد و یا استفاده طولانی از گارو نام برد . استفاده از ÷ی÷تها و لامهای شمارش غیر دقیق یا خوب مخلوط نکردن محلول سوسپانسیون گلبولی یا غلط پر کردن صفحه شمارنده و بالاخره عدم دقت لازم در شمارش سلولها همگی میتواند به نوبه خود موجب اشتباه در نتیجه شمارش گلبولهای قرمز شود.
-2 اشکالات محیطی : توزیع و پراکندگی نامناسب سلولها در روی محفظه ، لامهای شمارشگر یکی از مسائل تصادفی است که در مورد حتی سوسپانسیونهای سلولی خوب تهیه شده نیز رخ میدهد .
نتایج:
R1=16 R2=10 R3=14 R4=14   R5=12               n=64           x=10000×n      x=10000×64=640000
تعداد نرمال گلبول قرمز در هر لیتر خون به صورت زیر میباشد :
مردان : 5/6-9/3(1012)
زنان : 5/5 - 4 (1012)
نوزادان : 5/6 - 4 (1012)
در صورتی که تعداد گلبول های قرمز بیشتر از مقدار طبیعی باشد، فرد مبتلا به پلی سیتمی و در صورتی که تعداد گلبول های قرمز کمتر از مقدار طبیعی باشد، فرد مبتلا به آنمی است ( در لوسمی تعداد گلبول های قرمز کمتر از مقدار طبیعی می باشد.)